Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Используя классические методы определения биохимических параметров, мы не выявили их изменений в тканевых экстрактах мозга крыс в острой фазе развития ишемического инсульта. Например, уровни восстановленного глутатиона, холесторола, свободных жирных кислот заметно снижаются лишь через 24 часа с момента начала ишемии. По этой причине визуализация динамики изменения метаболических и окислительно-восстановительных параметров клеток in vivo в режиме реального времени в локальной зоне мозга с помощью генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоров представляет собой крайне актуальное и перспективное направление в области исследований патогенеза инсульта. Данный подход позволит регистрировать события в ткани мозга уже с первых минут развития повреждения. С помощью аденоассоциированных вирусов мы экспрессировали в клетках коры головного мозга крыс биосенсор SoNar для регистрации соотношения НАД+/НАДН. Далее с помощью специально собранной установки, подключаемой к вживленным в мозг животного оптическим волокнам, мы регистрировали in vivo, как изменяется флуоресцентный сигнал биосенсора в коре головного мозга при развитии ишемического инсульта. По нашим предварительным результатам масштабные окислительно-восстановительные события происходят не только в области поражения, но и в здоровом полушарии мозга. Наиболее выраженные изменения мы наблюдали в острой фазе ишемии-реперфузии. Данный метод изучения биохимических процессов in vivo при инсульте был применен впервые. На следующем этапе проекта мы планируем исследовать с помощью генетически кодируемых биосенсоров, как изменяются некоторые ключевые внутриклеточные параметры при развитии этой патологии отдельно в нейронах и клетках глии, а также в их компартментах.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Мы завершили часть Проекта, посвященную биохимическому анализу тканей мозга крыс при ишемии. Мы выявили, что использование классических биохимических подходов позволяет обнаружить изменения некоторых важных внутриклеточных параметров не ранее чем через 6 часов с момента начала развития патологии. При определении некоторых параметров (например, малонового диальдегида) достоверную разницу удалось зафиксировать лишь через сутки. Поэтому развитие подходов, позволяющих исследовать патогенез инсульта in vivo с первых секунд его развития, является крайне востребованным направлением. С помощью генетически кодируемых биосенсоров (SoNar, HyPer-3 и SypHer3s) мы исследовали, как изменяются такие внутриклеточные параметры, как соотношение НАД+/НАДН, концентрация пероксида водорода (Н2О2) и рН в условиях гипоксии в клетках нейробластомы SH-SY5Y, демонстрирующих нейрон-подобный фенотип. С первых минут гипоксии мы наблюдали значительное увеличение НАДН в цитоплазме клеток, что вероятно связано с активацией гликолиза. Последующая реоксигенация вновь нормализует соотношение НАД+/НАДН. Кроме того, гипоксия приводит к понижению рН цитоплазмы. Несмотря на общепринятое мнение о масштабной генерации активных форм кислорода (АФК) при ишемии-реперфузии, в данной системе мы зарегистрировали небольшое изменение сигнала биосенсора на Н2О2. Возможно, потому что биосенсор был локализован в цитоплазме, в то время как генерацию АФК при реоксигенации обычно приписывают митохондриям. Мы косвенно это проверили с помощью нового редокс-биосенсора, который мы разработали и протестировали во многих биологических системах в рамках настоящего Проекта. Новый биосенсор позволяет визуализировать динамику редокс-состояния пула глутатиона. Мы показали, что при гипоксии и последующей реоксигенации внутриклеточный глутатион значительно меняет свой редокс-статус именно в матриксе митохондрий, в то время как в цитоплазме этих же клеток изменений не происходит (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231718309340?via%3Dihub). Для in vivo системы мы получили коллекцию аденоассоцированных вирусов (AAV9 и AAV2), несущих гены биосенсоров SoNar (для регистрации соотношения НАД+/НАДН), HyPer-3 (для регистрации Н2О2) и SypHer3s (для регистрации рН) под общим промотором САG, а также специфическими промоторами hSyn1 (для экспрессии в нейронах) и GFAP (для экспрессии в астроцитах). Также были получены конструкции, содержащие сигнальные последовательности, для направленной локализации указанных биосенсоров в матриксе митохондрий выбранных типов клеток. Все полученные вирусы были протестированы на культуре клеток и в тканях мозга крыс. С помощью собранной высокочувствительной установки мы исследовали динамику биосенсоров SoNar, HyPer-3 и SypHer3s в коре головного мозга крыс при развитии ишемического инсульта в режиме реального времени. Для этого в кору головного мозга крыс в оба полушария были инъецированы соответствующие вирусы и имплантированы в эти же области мозга оптические волокна. Далее этим животным проводилась хирургическая операция по окклюзии средней мозговой артерии, приводящая к развитию ишемического инсульта. Регистрацию параметров мы проводили одновременно в двух полушариях мозга с момента введения животного в наркоз. Мы обнаружили, что после начала ишемии в коре больного полушария начинаются волнообразные изменения рН, выражающиеся быстрым закислением среды с последующим более медленным восстановлением. За период гипоксии, длившейся 90 минут, у большинства животных мы регистрировали как минимум две таких волны. Столь сильные изменения рН влияли на сигнал биосенсоров HyPer-3 и SoNar. По предварительным нашим результатам мы не зафиксировали мощной генерации Н2О2 при ишемии, в то время как биосенсор SoNar демонстрировал отличающуюся динамику сигнала, связанную вероятнее всего с увеличением в ткани НАДН. Окончательные выводы будут сделаны после дополнительной серии экспериментов. При восстановлении кровотока мы наблюдали мгновенное снижение рН, причем не только в области повреждения мозга, но и в здоровом его полушарии. Этот результат позволяет сделать вывод о том, что при ишемии-реперфузии резкое снижение рН характерно для всех тканей мозга, в том числе в областях, удаленных от самого очага инсульта. Данное наблюдение может оказаться крайне важным для изучения патогенеза инсульта и подбора терапии лечения. Кроме того мы усовершенствовали конструкцию установки и используемые нами методы, что позволит нам регистрировать исследуемые параметры одновременно в трех координатах мозга. С помощью нового подхода мы сможем регистрировать изменение параметров в ядерной зоне инсульта, а также формирующейся позже зоне ишемической полутени или, так называемой, зоне пенумбры, параллельно регистрируя при этом события в тканях здорового полушария. В настоящий момент мы полностью завершили тестовые эксперименты.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Мы полностью завершили тестирование полученной коллекции аденоассоциированных вирусов (серотипы 9 и 2/1), несущих гены биосенсоров SypHer3s, HyPer-3 и SoNar с использованием промоторов CAG, hSyn1 и GFAP. Биосенсор SoNar был протестирован в матриксе митохондрий в культуре клеток, однако полученная версия демонстрирует смешанный тип внутриклеточной локализации, поэтому не может быть использована in vivo. На предыдущих этапах Проекта регистрацию флуоресцентного сигнала биосенсоров проводили в коре головного мозга крыс в области, совпадающей с ишемической полутенью. К настоящему момент удалось инъецировать вирусные частицы и имплантировать оптические волокна в хвостатое ядро мозга обоих полушарий, таким образом, регистрировать биохимические события стало возможно непосредственно в ядерной зоне инсульта, формирующейся после окклюзии средней мозговой артерии. При развитии ишемического инсульта в нейронах и астроцитах в зоне повреждения происходят значительные изменения внутриклеточного рН. Для определения точного значения рН экспериментальная установка была откалибрована, для этого при одинаковых настройках сигнал рН-биосенсора SypHer3s был точным образом измерен на выделенном препарате белка при заданном значении рН в диапазоне 3,0 – 9,5, а также в цитоплазме клеток при использовании подхода точного изменения рН внутриклеточной среды в диапазоне 5,5 – 8,5. На основе полученных результатов была построена точная зависимость значения флуоресцентного сигнала от величины рН. При использовании одинаковых настроек оптическая установка позволяет с высокой точностью определить значение рН в тканях мозгах in vivo. В результате была зафиксирована динамика изменения рН в цитоплазме и матриксе митохондрий в нейронах и астроцитах в области хвостатого ядра головного мозга, эта структура попадает в ядерную зону инсульта. В этой точке головного мозга при окклюзии средней мозговой артерии происходит резкое снижение внутриклеточного рН в течение нескольких минут. В цитоплазме нейронов исходное среднее значение рН 7.71±0.17 снизилось до значения 7.06±0.15. В матриксе митохондрий нейронов значение рН 7.9±0.04 снизилось до значения 6.84±0.1. Пониженные значения рН сохраняются на протяжении всей длительности ишемии (60 минут). При восстановлении кровотока значение рН увеличивалось и достигало первоначальных значений в течение двух часов с момента реперфузии. Для астроцитов была зафиксирована схожая динамика изменения рН. В цитоплазме астроцитов исходное значение pH 7.68±0.03 при ишемии снизилось до значения 6.97±0.07 с последующим медленным увеличением до исходного значения после реперфузии. В матриксе митохондрий значение рН 7.69±0.02 снижалось до значения 6.96±0.08 при ишемии, после чего медленно возвращалось к норме после реперфузии. В этой же области мозга здорового полушария мы не зарегистрировали изменений рН в нейронах и астроцитах. Примечательно, что результаты отличаются от полученных ранее в коре головного мозга. В клетках коры головного мозга также происходило снижение рН после окклюзии сосуда, однако в течение ишемии рН в клетках возвращался к исходному значению. Реперфузия вызывала еще одну волну резкого падения рН, изменения были зафиксированы не только в области коры, попадающей в зону инсульта, но и в тканях коры здорового полушария. Из-за сильного изменения рН при ишемии-реперфузии не удалось выявить генерацию активных форм кислорода и достоверно определить изменения в редокс-статусе пула НАД, поскольку используемые биосенсоры HyPer-3 и SoNar чувствительны к колебаниям рН. Однако за последние 3 года появились биосенсоры нового поколения, которые характеризуются высокой яркостью, чувствительностью и стабильностью сигнала в условиях сильных изменений рН. В частности, мы протестировали новую версию биосенсора для регистрации пероксида водорода в живых клетках в условиях изменения рН. Данная версия биосенсора, флуоресцентный сигнал которой не изменяется при колебаниях рН, позволяет регистрировать в клетках пероксид водорода в условиях ацидоза, вызванного увеличением концентрации лактата. Подобного рода биосенсоры в сочетании с разработанным нами подходом исследования биологических процессов в мозге открывают новые возможности в медико-биологических исследованиях.